Imagerie histochimique de modules corticaux dans des sections cérébrales aplaties

Résumé

Source : Lauer, S. M., et al. Visualisation des modules corticaux dans les cortex aplatis de mammifères. J. Vis. Exp. (2018)
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p style='line-height :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>Cette vidéo montre une méthode pour visualiser les modules corticaux dans des sections de cerveau aplaties à l’aide de la coloration histochimique. Les sections préfixées sont traitées avec un réactif de tension qui met en évidence les amas neuronaux actifs, formant des régions sombres et à contraste élevé. Après le montage et la déshydratation, les modules corticaux apparaissent sous un microscope à fond clair sous la forme de motifs sombres et inégaux.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’examen éthique des animaux approprié.

1. Visualisation des modules corticaux à l’aide de la coloration à la cytochrome oxydase

REMARQUE : Différents protocoles de coloration ont été développés pour la détection histochimique de l’activité de la cytochrome oxydase. Ce protocole utilise du sulfate de nickel-ammonium (NiAS), ce qui permet d’obtenir un contraste plus élevé et des modules mieux définis dans les zones corticales colorées.

1. Préparez la solution de coloration de la cytochrome oxydase. Pour 10 ml de solution, ajouter 10 ml de tampon d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) (0,1 M, pH 7,4), 400 mg de saccharose, 12,5 mg de NiAS, 2 mg de cytochrome C et 6 mg de diaminobenzidine (DAB).
   ATTENTION : DAB et NiAS sont cancérigènes.
   REMARQUE : Ajouter DAB juste avant l’incubation des sections.
2. Laver les sections dans un tampon HEPES (0,1 M, pH 7,4) sur un shaker pendant 15 min.
3. Incuber les sections dans la solution de coloration à température ambiante sur un agitateur.
   REMARQUE : Observe la vitesse de la coloration. S’il n’y a pas de réaction visible, passer à l’incubation à 37 °C. Selon la quantité de fixation, une coloration peut être observée après 10 minutes ou en plusieurs heures.
4. Arrêtez la réaction en ajoutant 4 % de paraformaldéhyde (PFA) ; Cela permet d’éviter une nouvelle mort indésirable et une augmentation du signal de fond.
5. Lavez les sections trois fois à l’aide du tampon HEPES pendant 10 min.
6. Montez et séchez les sections sur des lames de verre.
7. Déshydratez les sections avec une ligne d’alcool croissante :
   1. Laver les diapositives avec de l’éthanol à 60 % pendant 1 min. Laver les lames avec de l’éthanol à 80 % pendant 1 min. Laver les lames avec de l’éthanol à 96 % pendant 2 min. Laver les lames avec de l’éthanol à 100 % pendant 3 min. Laver les lames avec de l’isopropanol pendant 5 min. Laver les lames avec du xylène pendant 5 min.
8. Ajoutez immédiatement un support de montage rapide et ajoutez une lamelle. Critical : N’utilisez pas de supports de montage à base d’eau, car les NiAS seront lessivés et dégraderont les taches.
9. Conservez les sections à 4 °C pour un stockage à long terme.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Coloration de la
Cytochrome c du cœur équin	Sigma-Aldrich	C2506
3,3'Diaminobenzidine tétrachlorhydrate	Sigma-Aldrich	D5637
HEPES	Carl Roth	9105.4
Supports
Eukitt (histochimie)	Sigma-Aldrich	3989
Déshydratation
Éthanol 100 %	Carl Roth	9065.3
Éthanol 96 %	Carl Roth	P075.3
2-Propanol	Carl Roth	6752.4
Substitut de xylène	Fluka	78475
Dispositifs/outils
Dumont 55 Forceps - Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont 5 Forceps - Inox Biology Tip Fine	Science Tools	11252-30
Dumont 5SF Forceps - Inox Super Fine Tip	Fine Science Tools	11252-00

cytochrome oxydasede montage ou de congélationde l’alcool